Các phương pháp sắc ký

HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký kết lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương thức sắc ký lỏng cao thế (High Pressure Liquid Chromatography).

Bạn đang xem: Các phương pháp sắc ký

1.Khái niệmPhương pháp sắc ký lỏng tính năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 bên trên cơ sở cải cách và phát triển và cách tân từ phương thức sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia bóc tách trong kia pha cồn là hóa học lỏng cùng pha tĩnh cất trong cột là chất rắn vẫn được phân loại dưới dạng đái phân hoặc một hóa học lỏng khóa lên một chất mang rắn, hay một chất sở hữu đã được đổi mới bằng link hóa học tập với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này càng ngày được sử dụng rộng thoải mái và thông dụng vì những lý do: tất cả độ nhạy bén cao, kĩ năng định lượng tốt, say đắm hợp tách bóc các hợp chất khó cất cánh hơi hoặc dễ dàng phân diệt nhiệt.Phạm vi ứng dụng của phương thức HPLC rất rộng, như phân tích những hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong nghành nghề thực phẩm, dược phẩm, môi trường…2.Phân loạiDựa vào sự khác nhau về cơ chế bóc tách chiết sử dụng trong HPLC, fan ta chia HPLC thành 4 loại:

Sắc ký kết hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography). Sắc ký phân bố (partition chromatography). Sắc ký ion (ion chromatography). Sắc ký kết rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).

Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được áp dụng nhiều duy nhất vì rất có thể phân tích được mọi hợp hóa học từ ko phân cực đến các hợp hóa học rất phân cực, hợp hóa học ion có trọng lượng phân tử không thật lớn (SKPB được tạo thành hai loại dựa trên độ phân cực kha khá giữa trộn tĩnh cùng pha động: sắc cam kết pha hay – SKPT (normal phase chromatography) với sắc ký kết pha hòn đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography).Trong SKPT, trộn tĩnh áp dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Trộn tĩnh một số loại này sẽ sở hữu được ái lực với các hợp chất phân cực. SKPT dùng để bóc tách và phân tích những hợp chất có độ phân cực cao cùng với phân tử lượng khiêm tốn lắm.SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong những số đó pha tĩnh không nhiều phân rất hơn trộn động. Phương thức này sử dụng phân tích các hợp hóa học từ không phân cực cho phân cực. Hầu hết các hợp hóa học hữu cơ bao gồm mạch carbon nhiều năm (ít phân cực) rất phù hợp cho phân tích bởi SKPĐ. Dung môi sử dụng trong SKPĐ là những dung môi phân cực, trong những số đó dung môi nước vào vai trò đặc biệt mà lại rẻ tiền. Bởi đó, SKPĐ được vận dụng nhiều và phổ cập hơn SKPT.3. Pha tĩnh vào sắc ký trộn đảo Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là phần nhiều hợp chất hữu cơ được thêm lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ bỏ silica theo hai kiểu:

Pha tĩnh được lưu giữ trên hóa học mang rắn bởi cơ chế hấp phụ đồ gia dụng lý → sắc cam kết lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography). Trộn tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký kết pha links (bonded phase chromatography)Trong quy trình sử dụng, fan ta phân biệt sắc ký kết pha liên kết có không ít ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng bởi một số lý do sau: pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ dẫn đến hòa tan vì pha động buộc phải dễ bị mất đuối pha tĩnh trong thời hạn sử dụng với gây nhiễm đối với hợp hóa học phân tích. Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan vào pha rượu cồn nên fan ta chẳng thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi.

Vì vậy, fan ta thường xuyên chỉ để ý đến loại sắc đẹp ký phân bố pha liên kết và phần nhiều các một số loại cột sử dụng hiện nay trong sắc đẹp ký phân bố đều có cấu trúc dạng này.Bề mặt những hạt silica – SiO2 (các hạt này còn có đường kính 3, 5 hoặc 10 µm) được cách xử trí (thủy phân) bằng phương pháp đun rét với HCl 0,1M vào một hoặc nhị ngày để tạo nên những team SiOH như sau (thông thường xuyên chỉ có khoảng 8 µmol SiOH/m2 bề mặt):

Sau đó bề mặt silica đang thủy phân này sẽ được cho phản bội ứng với những organochlorosilan để tạo nên các trộn tĩnh ko phân cực, phân cực trung bình hoặc khôn cùng phân cực phụ thuộc vào nhóm R thêm vào.

Thường chỉ khoảng 1/2 nhóm –OH mất H+ để tạo thành HCl (tức đúng theo chất yêu cầu phân tích khi trải qua pha tĩnh có khả năng sẽ bị giữ lại bởi những lực lượng tương tác khác nhau tùy thuộc tính chất, điểm sáng của hóa học tan và pha tĩnh.Trong SKPĐ, nhóm cố kỉnh R vào hợp chất siloxan số đông không phân cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl dây khá dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn hoàn toàn như là C2; bên cạnh đó còn có cyclohexyl, phenyl trong những số đó nhóm phenyl bao gồm độ phân cực cao hơn nữa nhóm alkyl. Fan ta nhận ra các alkyl dây rất dài cho kết quả bóc tách ổn định hơn những loại khác nên đấy là loại được thực hiện nhiều nhất.

Tuy nhiên bởi vì hiệu ứng lập thể phải trong cấu tạo của pha tĩnh còn nhóm –OH chưa phản ứng, gây ảnh hưởng xấu mang lại quá trình bóc sắc cam kết tùy môi trường pH phân tích.Trong môi trường thiên nhiên quá acid (pH Trong môi trường xung quanh baz (pH > 7), chủ yếu nền silic với pha tĩnh có thể bị tổ hợp (SiO2 thành silicat), hệ quả là N giảm và số nhánh ghép cũng giảm, mũi rộng ra và thời gian lưu cũng có thể giảm. Công dụng phân tích do vậy sẽ thiếu tính độ thiết yếu xác.Một giữa những cách xung khắc phục hiện tượng này là dùng những chất như trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazan (ít sử dụng hơn) để cửa hàng với đội –OH này (gọi là hiện tượng lạ end-capping). Bây giờ ta sẽ có loại cột ít tương tác với chất phân tích gồm tính baz (cột LC-DB của hãng sản xuất SUPELCO).

Có một phương pháp khác để sa thải bớt ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần tác động với nó là thay phần đa nhóm methyl của –Si(CH3)2-C18 bởi những nhóm vắt lớn hơn hoàn toàn như là isopropyl để phần đông nhóm này sẽ che đi đầy đủ nhóm –OH, cản trở tương tác của tập thể nhóm –OH cùng với chất nên phân tích.

Người ta còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân rất để tăng lên độ phân cực của dây C18, làm cột tất cả khả năng tách chọn lọc hơn so với những hợp chất phân cực mạnh mẽ (cột EPS – Expended Polar Selectivity).Ngoài sườn silica, thời gian vừa mới đây người ta có sử dụng đến nền vật liệu nhựa polystyren (Polystyren Reversed Phase – PRP) được cho phép phân tích trong môi trường xung quanh pH từ là 1 – 13. Cột này dễ sử dụng trong môi trường thiên nhiên acid với baz mạnh. 4. Pha đụng trong sắc ký trộn đảo Pha cồn trong sắc ký lỏng nói chung đề nghị đạt hầu như yêu ước sau: Hòa tan mẫu mã phân tích. Tương xứng với đầu dò. Không tổ hợp hay có tác dụng mòn trộn tĩnh. Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao. Tinh khiết cần sử dụng cho sắc ký (HPLC grade).

Trong sắc ký pha đảo, dung môi trộn động có độ phân rất cao. Trên lý thuyết bạn cũng có thể sử dụng không ít dung môi nhưng kinh nghiệm tay nghề thực tế cho biết methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) với tetrahydrofuran (THF) là đã đạt được yêu cầu nhất. Nước là một dung môi được mang lại vào những dung môi hữu cơ nhằm giảm tài năng rửa giải.Mỗi dung môi đều đặc thù bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ (refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index), độ rửa giải (eluent strength)…Trong kia độ phân cực và độ rửa giải có tác động ảnh hưởng lớn lên khả năng phân bóc của các mũi nhan sắc ký.

Có ba thông số kỹ thuật gây tác động lớn đến tách các mũi sắc ký: số đĩa kim chỉ nan N, hệ số dung tích K’, độ chọn lọc α . Khi sự biến đổi thành phần pha cồn không mang về kết quả bóc tách mũi theo yêu mong thì họ phải nuốm đổi thực chất pha cồn (sử dụng dung môi khác), tức đổi khác α. Đôi khi rất có thể phải chuyển đổi cả pha tĩnh.Trong vượt trình bóc của SKPĐ, sự xúc tiến giữa phù hợp chất đề xuất phân tích và pha động dựa vào rất các vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton) hoặc tính baz (nhận proton) của dung môi.Thông thường xuyên pha rượu cồn trong SKPĐ bao gồm một hỗn đúng theo nước hoặc dung dịch đệm với một hoặc những dung môi hữu cơ phân rất tan được vào nước. Nước là 1 trong những dung môi vô cùng phân cực nên nó không can dự với phần nhiều nhóm alkyl ko phân rất trong trộn tĩnh, do đó nó được coi như pha cồn yếu nhất và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong toàn bộ các dung môi đụng của SKPĐ.Hỗn phù hợp nước cùng dung môi hữu cơ thường làm tăng thêm độ nhớt dẫn tới việc tăng áp suất cột.

Việc tuyển lựa dung môi và thành phần dung môi trong pha rượu cồn được tối ưu hóa cho gần như hợp chất yêu cầu phân tích. Thông thường, fan ta áp dụng hỗn vừa lòng dung môi MeOH/nước trước, rồi ACN/nước hay THF/nước. Với một hỗn hợp chất phân tích phức hợp thì sẽ sở hữu được sự trộn lẫn của những dung môi cơ học với nước. Khi chọn lọc thì cần chọn các hỗn thích hợp MeOH, ACN và THF cùng với nước tất cả độ rửa giải tương đồng.Thành phần pha động tất cả thể cố định và thắt chặt trong suốt quy trình chạy sắc cam kết (chế độ isocratic) hoặc được biến hóa theo một công tác đã định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu quả bóc tách tốt hơn.5. Một số đại lượng cơ bản trong đối chiếu sắc ký5.1. Thông số phân bốCân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký hoàn toàn có thể được tế bào tả bởi phương trình như sau:

Hằng số cân đối K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng số phân bố (partition coefficient) và được xem như sau:

Với CS : mật độ cấu tử trong trộn tĩnh.CM : mật độ cấu tử trong trộn động.Hệ số K tùy thuộc vào thực chất pha tĩnh, pha đụng và chất phân tích.5.2. Thời hạn lưu:tR : thời hạn lưu của một cấu tử từ khi vào cột mang lại khi bóc tách ra ngồi cột.tO : thời gian để cho chất như thế nào đó không tồn tại ái lực với trộn tĩnh trải qua cột; này cũng là thời hạn pha hễ đi từ trên đầu cột mang đến cuối cột và nói một cách khác là thời gian giữ chết.tR" : thời hạn lưu thật của một cấu tử.

Với VS :thể tích pha tĩnhVM :thể tích trộn độngNếu k’~ 0, tR~ tO: chất ra siêu nhanh, cột không có khả năng giữ hóa học lại.Nếu k’ càng khủng (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng lâu, mũi có tác dụng bị tù.Khoảng k’ hài lòng là 2-5, nhưng khi phân tích một các thành phần hỗn hợp phức tạp, k’ bao gồm thể gật đầu trong khoảng rộng 1-20.

Xem thêm: Cách Làm Gỏi Rong Biển, Gỏi Rong Sụn, Món Gỏi Rong Biển Ngon, Bổ, Đẹp

5.4. Hiệu năngHiệu năng tốt số đĩa định hướng N của cột đặc trưng cho khả năng bóc tách mũi sắc ký của những cấu tử trên cột. N càng lớn, hiệu năng bóc càng cao. Số đĩa lý thuyết có thể đo bên trên sắc ký kết đồ. Fan ta minh chứng được:

Với W1/2 là chiều rộng lớn mũi sắc ký tại vị trí ½ độ cao mũi (phút)W là chiều rộng mũi sắc ký ở đoạn đáy mũi (phút)5.5. Độ lựa chọn lọcĐặc trưng đến khả năng bóc hai chất của cột.

5.6. Độ phân giải:Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba tài năng của cột dung nhan ký: sự giải hấp, sự tinh lọc và kết quả tách. Nó được xác định qua phương trình sau: